伊－400级长293英尺（89.3064米），水上排水量3550吨，水下排水量6560吨，是二战期间建造的最大潜艇。设计最高航速水上20节，水下7节，航程33,000海里/16节，可持续作战四个月以上，作战半径可达到世界上任何一个角落。武器包括艇尾的1门5.5英寸（140mm）50倍身管长甲板炮，艇首8具鱼雷发射管，指挥塔上1门25mm防空炮，机库上方3座三联装25mm防空炮，此外还有3架爱知造M6A1“晴岚”水上战斗/轰炸机。“晴岚”是专门为搭载于潜艇上而开发的机种，可携带800公斤炸弹或17.71英寸（450mm）直径的空投鱼雷。伊－400型的主甲板上有一座115英尺长，直径12英尺的机库，可容纳三架折叠的“晴岚”。机库口延伸出一条85英尺长的弹射滑索，平时飞机被折叠起来放入机库，作战时依次拖到弹射器上展开机翼，加油装弹并弹射起飞。完成任务后降落在母舰附近的水面，由可折叠的起重机吊回舰上。另外，伊－400型还装有柴油机通气管工作装置、警戒雷达和雷达讯号接收机。
伊－400级的主舰体采用横向双筒结构，很象一副眼镜，这是为保障艇内弹药库和巨大燃料箱的安全而专门设计的。设置在船尾的乘员舱室恢复为单筒，这种双筒设计使其具有较好的稳定性。艇首有两个鱼雷舱室，每舱有纵列的四具21英寸口径鱼雷发射管，共备雷二十条。伊－400级的下潜时间为56秒，吃水为23英尺。设计潜深400英尺（121.92米），试航中潜到了328英尺（99.9744米）。（1英尺=0.3048米）
伊－400型的舰桥和指挥塔并不在潜艇正中，而偏离中线7英尺，为保持全艇得平衡，机库位置相应向反方向偏移2英尺。因为这种不对称的设计，在遇到紧急情况或发射鱼雷时，伊－400级在水下的操作较不稳定。
搭载于伊－400级潜艇上的“晴岚”水上战斗／轰炸机长35英尺，翼展40英尺，航程654英里，有效载荷1800磅。如果丢弃浮筒，“晴岚”还可以搭载附加油箱和炸弹，执行“敢死”任务。“晴岚”由爱知公司制造，平时装载于艇上的耐压机库中，浮筒被拆开放置，机翼和尾翼可折叠。一支训练有素的队伍可以在七分钟内装备好一架“晴岚”。
伊－400级起初设计艇员为145人，后来增加为213人，一名日本军官介绍实际作战中搭载220人。经过训练的艇员可在45分钟内完成“晴岚”的装配、加油、挂弹和弹射。伊－400级的巨大航程使其可以攻击远在旧金山、巴拿马、华盛顿或纽约的目标。
机库的下方有一间舱室，可用以进行艇载机的维修和检查，隔壁的弹药室存放有四条空投鱼雷，十五枚炸弹，以及大量的机枪弹药，这些舱室的上方都有厚实的装甲保护。两个机舱各安装一台1900马力的柴油发动机。
每条轴连接一台1200马力的发电机，提供潜艇下潜用的电力。实际运行中，潜艇达到了水上18.7节，水下6.5节的最高速度。
伊400级装有日本的早期预警雷达和雷达信号探测器，为了弥补雷达性能的不足，舰桥上还安有特大型的双筒潜望镜。为了支持长达四个月的远洋作战，食物和补给品被塞进潜艇的每一个角落，狭窄的过道上也摆着食品箱，人只能弯着腰走在上面。
1943年1月18日，伊－400号在吴县海军造船厂开工建造，伊－401号及伊－402号不久后在佐世保开工，伊－403号原定在川崎海军造船厂开工建造，后因故取消，伊－404号于1944年2月在吴县造船厂安放龙骨，后在盟军的猛烈空袭中沉没。
为伊－400级制订的第一个作战计划是由联合舰队代理司令小泽治三郎制订的，称为PX行动，计划出动10架艇载机对美国西海岸及太平洋上一些人口稠密的岛屿投掷细菌武器。日本设在满洲的731细菌部队已经在无辜的中国人和一些欧洲人战俘身上完成了人体实验，通过被感染的老鼠和昆虫散布许多可怕的疾病，包括鼠疫和黑死病。
1945年3月26日，丰田辅武海军上将取消了该计划，理由是“使用细菌武器将导致与全人类的对抗”。取而代之的计划是轰炸旧金山、巴拿马、华盛顿或纽约等城市。其中出动艇载机炸毁巴拿马运河的计划最终被采用，这将使美国海军数月内无法通过该运河输送兵力。
但是，到巴拿马运河来回长达17,000英里（27358.848公里）的航程使每艘潜艇起码需要达载1600吨的燃料，战争末期的吴县军港根本搜刮不到这么多柴油。伊－401号因此被派到中国的大连运送燃料。4月12日，这艘倒霉的潜艇在日本海碰上一枚B－29布下的水雷，受轻伤返回修理。伊－400号代替它再次出动，总算运回了需要的油料。
到6月上旬，计划中的所有四艘潜艇都已加满燃料，装足武器，更换了新型的通气管装置，并装上了迷惑美军的假烟囱。他们离开吴县军港，向北穿过对马海