海大学协助办校。在于和邓中夏、瞿秋白、叶楚伧、邵力子、刘觉民等人的努力下，上海大学很快成为第一次国共合作时期在国内很有影响的一所大学。
1924年1月，于出席中国国民党一大，提出了国共两党“合则两益，离则两损”的著明论断，被选为中央执行委员。10月，北京政变成功，冯玉祥、胡景翼等邀请孙中山、于右任、刘觉民等人北上。12月31日，孙中山抱病到京。不久，命于和汪精卫等组成国民党中央北京政治委员会，处理北方国民党事务。1925年，国民政府在广州成立，于被选为国民政府委员。12月，段祺瑞改组国务院，特任于为内务总长，于坚辞未就。1926年1月，中国国民党二大会上，于继续当选为中央执行委员。
1926年“三一八”惨案发生后，于对爱国学生的遇难十分痛心，亲自筹款，帮助陕西旅京学生会安葬死难和抚恤受伤的陕籍学生。后受李大钊之请，赴莫斯科敦促冯玉祥回国参加北伐，并解被刘镇华围困的西安城围。冯、于回国后，于9月17日在绥远五原(今属内蒙古)誓师成立国民军联军，冯任总司令，于代表国民党和国民政府监誓、授旗，并任副总司令。接着，于随援陕先头部队，经宁夏、固原、平凉等地进入陕境。11月下旬，刘镇华全线溃退，西安解围，于以国民军联军驻陕总司令的名义进驻西安，代行全省政务。12月22日，于和联军驻陕副总司令邓宝珊发表就职宣言，提出废除旧的政治体制、统一全省财政等12项整理陕西军政的计划，号召民众“共同起来呀!建设美满幸福的新生活吧!”1927年2月，根据联军总司令部决定，将西北大学改建为西安中山学院，还创办了西安中山军事学校，为革命培养人才。此前后，联军驻陕总司令部发布许多法令，取消苛捐杂税，减少农民地租；政治部和教育厅还翻印了大量革命书籍，并允许各种进步书刊公开发行。在于、邓的支持和大批回陕的旅外学生推动下，全省工、农、学生、妇女运动蓬勃发展，出现了陕西近现代史上少有的革命高潮。“四一二”蒋介石叛变革命，国民党省市党部接连召开讨蒋大会。于在4月27日陕西省党部召集的大会上，痛斥蒋介石“叛党叛国之罪恶”(1927年5月17日《汉口民国日报》)。
宁汉合流以后，国民政府任命于右任为陕西省政府主席，未到任。1928年2月出席国民党二届四中全会，被推选为国民党中执委会常务委员、国民政府常务委员，还被指定为军事委员会常务委员。在同月下旬召开的国民党中央政治会议上，又被推为国民政府审计院院长。1930年11月，于在南京出席国民党三届四中全会，被推为主席团五成员之一。这次会上，他被推选为国民政府委员兼监察院院长。第二次国共合作期间，于与中国共产党保持着良好的关系。1938年1月，中国共产党领导的《新华日报》在武汉创刊，于应邀为该报题写报头；到重庆后，于仍通过屈武与中共保持联系。汪精卫公开投降日寇后，他口诛笔伐，并赞成将其永远开除出国民党。于还为《大公报》撰文，首倡将对中国含有篾意的地名“印度支那半岛”改名为中南半岛。1945年9月，毛泽东赴重庆谈判期间，曾专程去看望过于。于亦设宴款待毛泽东。
1948年春，于出席在南京召开的第一届“行宪国民大会”，与孙科、李宗仁、程潜、莫德惠、徐傅霖六人竞选副总统，落选后仍任监察院院长。这时，他极力希望通过和谈解决中国问题。1949年2月15日，由颜惠庆、章士钊、江庸、邵力子组成的“上海人民和平代表团”到北平、石家庄等地，与毛泽东、叶剑英等中共领导人协商和谈事宜。2月27日，颜、章等人返回南京时，于亲往机场迎接。同年4月，国共和谈在北平正式举行。李宗仁原拟派于作为特使去北平，于亦欣然受命，并做好了动身的准备。但正在北平参加和谈的国民党首席代表张治中认为，于暂不离开南京可以促使南京政府批准和谈协定，待南京政府批准和谈协定后，由于到北平主持签字。李宗仁接受了张治中等的建议，于遂未能成行。周恩来闻知，对于的处境十分担忧。当国民党和谈代表黄绍和代表团顾问屈武携带《国内和平协定》草案去南京复命时，特别请屈武到南京后立即转告于，“如果南京政府拒绝批准这个《国内和平协定》，我们渡江占领南京时，希望于先生在南京不要动，到时候我们会派飞机接他来北平，将来同张澜、李济深和沈钧儒先生一道，组织新政协，我们一同合作。”屈武到南京后向于转达了周恩来的意见，但这时他已身不由己。4月20日，国民党拒绝接受《国内和平协定》，人民解放军发起渡江战役。国民党军政机关撤往广州，于被“护送”至上海。25日由沪抵穗，继续主持监察院院务。7月16日，国民党中常会正式决定成立挽救残局的最高决策机关中央非常委员会，蒋介石、李宗仁为正副主席，于是九委员之一。广州解放前于到香港，11月26日奉召到重庆，28日离渝，29日被迫飞抵台湾；原配夫人高仲林、长女于芝秀等亲属仍留在大陆。暮年孤独无依，深念大陆亲人，抑郁苦闷，无以释怀，于1