做着最后的努力。十二月二十七日，毛泽东一面请周恩来继续向蒋介石交涉，要他命令李品仙不得妨碍新四军北移；一面以朱德、叶挺的名义急电国民党第五战区司令长官李宗仁和副长官李品仙，恳请他们从抗战的利益出发，不要妨碍新四军的北移。
但是，这时的形势已难以逆转。顾祝同根据蒋介石将皖南新四军“一网打尽，生擒叶项”的命令，已完成围歼皖南新四军的准备，震惊中外的皖南事变终于爆发了。
一九四一年一月四日，新四军军部及直属部队九千余人遵令北移。由于项英的犹豫不决，行期一再延误，国民党已在新四军行进的必经地区埋下重兵。六日，仓促行动的部队到达泾县茂林地区时，突然受到国民党第三十三集团军总司令上官云相指挥的七个师八万余人的严密包围和猛烈袭击。双方兵力悬殊，国民党军队又已作了充分准备，新四军陷入苦战中。
因为通讯被阻断，事情发生后三四天，毛泽东才得到确实消息。他先收到的是刘少奇在一月九日发来的两封电报，一封电报说“我江南遵令北移被阻，战况激烈，请向国民党严重交涉”(50)；另一封电报报告：项英、袁国平等“在紧急关头已离开部队，提议中央明令撤项职，并令小姚（饶漱石）在政治上负责，叶（挺）在军事上负责，以挽危局”。(51)十日，毛泽东才收到叶、饶紧急求救电和在突围不成后又回到部队的项英自请处分的电报。他立即决定，由叶挺、饶漱石指挥新四军，克服困难，继续执行北移任务。并要刘少奇、陈毅“就近随时去电帮助他们并加鼓励，惟项英撤职一点暂不必提”。(52)一月十二日，中共中央召开政治局会议，通过了毛泽东起草的指示电：“中央决定一切军事、政治行动均由叶军长、饶漱石二人负总责，一切行动决心由叶军长下，项英同志随军行动北上。”
新四军军部的命运紧紧牵动着毛泽东的心。他反复考虑着如何把他们从危难中解救出来。一月十四日，他在致周恩来、叶剑英的电报中指出：这“是救死问题，如不停止进攻，即将全军覆灭。请立即要蒋下令停战撤围”(53)。出于这种焦急不安的心情，中共中央决定“在政治上军事上迅即准备作全面大反攻，救援新四军，粉碎反共高潮”。(54)中央指出，如皖南部队被蒋介石消灭，我应坚决、彻底、干净、全部消灭韩德勤、沈鸿烈部，彻底解决华中问题。
由于力量过于悬殊，皖南新四军在奋战七天七夜后，终于因弹尽粮绝而失败。奉命同国民党军队谈判的军长叶挺被扣；项英、袁国平、周子昆等遇难。一月十五日，中共中央召开政治局会议，检讨新四军失败的原因，毛泽东指出：从我们自己方面来说，首先是由于项英、袁国平等没有反磨擦的思想准备，其次是指挥上的错误。他提出：袁、项的错误须立即宣布，如何处置交七大解决。会议通过了毛泽东起草的《中央关于项袁错误的决定》。在这次会上毛泽东提出：我们要实行全国的政治反攻，像我们前次反对第一次反共高潮时一样非常强硬的态度，只有不怕决裂，才能打退国民党的进攻。他又说：左派主张我们马上与国民党大打起来，我们也不能实行这种政策。(55)
一月十七日，蒋介石发布取消新四军的命令，把叶挺交付军事法庭审判，将反共高潮推到顶点。国共关系已处于异常紧张的状态。这时，毛泽东反而更加冷静。他接受了刘少奇的建议，提出“在政治上取猛烈攻势，而在军事上暂时还只能取守势”。(56)
一月二十日，中共中央召开政治局会议，讨论对付时局的办法。毛泽东指出，要挽救时局，实现好转，必须由国民党当局取消一月十七日的命令。会议决定：成立中央军委主席团，由毛泽东、朱德、彭德怀、周恩来、王稼祥组成，军委实际工作由主席团办理。驻国民党统治区的各办事处实行撤退。
当天，根据政治局会议决定，在延安发布了毛泽东为中共中央革命军事委员会起草的重建新四军军部的命令，任命陈毅为新四军代理军长，张云逸为副军长，刘少奇为政治委员，赖传珠为参谋长，邓子恢为政治部主任。随后，新四军军部在苏北盐城成立，整编全军为七个师和七个独立旅，共九万多人，在大江南北坚持敌后抗战。
同时，也根据政治局会议的决定，毛泽东以中共中央革命军事委员会发言人的身分对新华社记者发表关于皖南事变的谈话。他指出：“此次皖南反共事变，酝酿已久。目前的发展，不过是全国性突然事变的开端而已。”“特别是一月十七日的命令，包含着严重的政治意义。因为发令者敢于公开发此反革命命令，冒天下之大不韪，必已具有全面破裂和彻底投降的决心。”他说：“目前全国人民的紧急任务，在于以最大的警惕性，注视事变的发展，准备着对付任何黑暗的反动局面，绝对不能粗心大意。”
那么，事情是不是已经到了非决裂不可的地步呢？毛泽东提出了解决皖南事变的十二条办法：第一、悬崖勒马，停止挑衅；第二、取消一月十七日的反动命令，并宣布自己是完全错了；第三、惩办皖南事变的祸首何应钦、顾祝同、上官云相三