队立刻抓紧时机向皖东敌后发展，到三月间就从原来的五千人发展到一万五千人左右，为向苏北发展开辟了道路。
新四军刚取得一点发展，蒋介石立刻命令国民党第三战区司令长官顾祝同，第五战区副司令长官、桂系将领李品仙，第三十一集团军总司令汤恩伯，苏鲁战区副总司令韩德勤等部向江北新四军进攻。这是国民党顽固派企图在华中发动新的反共高潮的信号。
面对这种严峻局势，毛泽东立即发出“磨擦中心将移至华中”的警告，并且及时作出如下部署：“以淮河淮南铁路为界，在此线以西避免武装斗争，在此线以东地区则应坚决控制在我手中。”“将来八路军到达华中后，则应坚决争取全部苏北在我手中，陈毅部队立即应当向苏北发展。”他提醒处在国民党军队三面包围下的皖南新四军军部：“顽方有可能利用其优势兵力向新四军军部地区进攻，因此军部及皖南部队应预先有所准备，以免遭袭击，万不得已时可向苏南陈支队靠拢，再向苏北转移。”⑤四月一日，毛泽东又为中共中央和中央军委起草电报，要求八路军立即抽调四万至五万人的兵力，在三个月内外到达华中，增援新四军，创建新的敌后根据地。
遵照毛泽东的部署，江北的新四军以劝告和争取的态度暂时制止了桂军的东进，同时在军事上击退了苏北方面韩德勤的进攻。
四月初，蒋介石要求朱德、周恩来赴重庆谈判华中问题，顾祝同也邀请新四军政治部主任袁国平赴上饶商讨新四军的活动区域。毛泽东已经清醒地看到：“目前局势相当严重，蒋介石似已下了这样的决心，即是挂抗日的招牌，做剿共的实际。”⑥但从大局出发，他仍同意周恩来去重庆通过谈判来力争时局好转。同时，他又起草给彭德怀、黄克诚、刘少奇等的电报说：蒋介石“与我谈判条件，欲把我八路军、新四军统统纳入黄河以北，划定黄河以北为我两军防区的企图。但第一，华北敌占领区日益扩大，我之斗争日益艰苦，不入华中不能生存。第二，在可能的全国性突变时，我军决不能限死黄河以北而不入中原。故华中为我最重要的生命线。第三，此次蒋令韩德勤、李品仙、李宗仁、卫立煌及所有鄂豫皖苏各军向我新四军进攻，衅自彼开，故我仍应乘此时机派必要军力南下。”⑦
这时，蒋介石已打算将军事进攻的重点从江北移到江南。他们分析江南新四军的情况后认为：“叶、项在皖南，如瓮中之鳖，手到擒来；陈、粟在苏南，如海滨之鱼，稍纵即逝”⑧。因此，顾祝同在谈判中多次提出要江北新四军全部南调，以便切断新四军和八路军会合的可能，并使他们集中到苏南狭小地区后再加消灭。
对国民党的这种企图，毛泽东已有察觉，他认为，新四军在苏北有力地打击韩德勤部的进攻后，顾祝同一定会对皖南、江南的新四军采取加紧压迫的手段。他最担心的是皖南的情况，因为停留在皖南的新四军军部，北面是受到日本军舰严密封锁的长江，东、南、西三面都有国民党的重兵，随时有被突然袭击的可能。他致电项英，询问新四军“军部及皖南部队被某方袭击时，是否有冲出包围避免重大损失的办法？其办法以向南打游击为有利，还是以向东会合陈毅为有利？渡江向北是否已绝对不可能？”⑨等问题。稍后又电告项英：“顾（祝同）有对皖南江南我军采取压迫手段之可能，望项准备应付办法，唯决不可先动手，应取自卫原则为有利。”⑩
江南的新四军正处于险境之中，这已是十分清楚的事实。但对如何走出险境，项英同陈毅、粟裕之间又出现不同意见。项英认为：“江北部队不南调，冲突仍不免，全国局势日益恶化”，主张“江北之叶（飞）、张（道庸）两团全部急返江南，以应大事变”。⑾陈毅、粟裕则认为“皖南地非敌后，处在三战区包围圈中。苏南是我军对日作战和向东向北发展的基地。而且以当时我军的兵力来看，暂难在皖南、苏南两处应敌。为此，我们建议皖南军部率部即向苏南靠拢”。⑿毛泽东和中共中央支持陈、粟的意见。四月二十六日，中央书记处致电项英、陈毅并告刘少奇、张云逸：“皖南军部以速移苏南为宜。”并再次重申一条重要的原则：“在团结抗战时期，我军不应向友党后方行动，而应向战争区域与敌人后方行动。”⒀
局势已日见恶化，而项英的犹豫不决只会使正在恶化的处境更加恶化。五月四日，毛泽东为中共中央起草给东南局及新四军的指示，对项英提出尖锐的批评：
“在一切敌后地区和战争区域，应强调同一性，不应强调特殊性，否则就会是绝大的错误。不论在华北、华中或华南，不论在江北或江南，不论在平原地区、山岳地区或湖沼地区，也不论是八路军、新四军或华南游击队，虽然各有特殊性，但均有同一性，即均有敌人，均在抗战。因此，我们均能够发展，均应该发展。这种发展的方针，中央曾多次给你们指出来了。所谓发展，就是不受国民党的限制，超越国民党所能允许的范围，不要别人委任，不靠上级发饷，独立自主地放手地扩大军队，坚决地建立根据地，在这种根据地上独立自主地发动群众，建立共产党领导的抗日统一